F.SIGHT 2.0提高MSC間充質干細胞的單克隆率

早在1976年，德國科學家Frieden Stein和他的同事在骨髓中發現了間充質干細胞（MSCs），后來的研究者發現間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC)是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，在特定的誘導條件下，能夠分化成不同類型的細胞，包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞等，而且沒有醫學倫理的困擾，所以受到科學家的青睞，被廣泛應用于組織再生、器官修復、血液病、癌癥治療等領域。

MSC的體外培養擴增不可避免地經歷復制性衰老，伴隨著基因組不穩定性，這是MSC細胞治療行業一個嚴重的障礙。此外，因為接種起始MSC細胞濃度不一樣，即使經過相同的擴增代數，細胞的復制周期是不一致的，導致批次間生產的MSC細胞的穩定性差，這也是目前MSC細胞在治療行業的一個瓶頸。 因此通過單一MSC細胞來源的穩定細胞株為提供可持續的、穩定的MSC細胞生產成為關鍵，可以助力MSC干細胞治療行業的快速發展。

為什么要挑選MSC細胞的單克隆細胞株？

細胞單克隆性，一般指用于建立最初的種子庫細胞為單個細胞來源。藥物生產過程中，具有單克隆源性的細胞庫能夠更好地保持產品批次之間的質量一致性，因此在三級細胞庫建立過程中細胞的來源一致性尤為重要；這一點也是預防種子庫細胞變異的風險的關鍵，也可更好的對上游工藝開發和下游產品質量的把控。

相反的，多克隆細胞系構建成功后不同細胞克隆生長速度不一致，目的基因表達量比較低的細胞克隆增殖速度一般更快，因此在最初的10代左右會觀察到表達量逐漸下降，且不能長期維持細胞表型。

考慮到產品安全性，FDA的政策和法規都要求生物制藥企業提供清晰圖片證據，用以證明生產用的細胞株的單克隆源性。

本文詳細介紹了利用Cytena公司開發的單細胞打印技術(SCP technology)，通過將單個的MSC細胞自動分離到標準的96/384孔板中，大大加速MSC單克隆細胞株的開發。

材料與方法

1、細胞類型：貼壁的間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）。

2、樣品處理方法：

1)   用胰丨  酶消化處理MSC細胞，變成懸浮細胞；

2)   用biosharp DMEM低糖培養基清洗重懸細胞，用40 μm的篩網過濾樣品，去除細胞團塊；

3)   按照7E5cells/ml的密度，將細胞加入一次性的分選芯片中。

3、分選工具：德國Cytena單細胞打印機F.SIGHT 2.0和一次性Catridge

圖1：克隆篩選單細胞打印系統分選流程圖（single-cell printer™，scp™） 

結果

表1是通過SCP^TM和手動-LD方法分選的多塊96孔細胞培養板的統計結果，我們可以發現SCP^TM分選的D0單細胞率是手動-LD的4倍，在培養15天后統計“單克隆率”發現是手動-LD的3.67倍之多(表2)！

表1：MSC細胞單細胞率統計表

由于MSC細胞是貼壁細胞，細胞的結團率比較高，所以MSC的單細胞率不像懸浮類細胞的高（CHO單細胞率可以達95%以上），但是相比于平行的有限稀釋法來說，單細胞率也提高了近4倍，提高了單克隆的篩選效率。

表2：MSC細胞單克隆率統計表

采用一次性的微流控芯片進行單細胞分選，每次只產生約150pL的液滴，單細胞率高。無菌的一次性的芯片可以避免項目之間的交叉污染，設備無需清洗和驗證，有利于日后項目的申報審批。

圖2：微流控Cartridge芯片（150pL/單液滴體積）

討論

單細胞率是決定單克隆率高低的關鍵性因素，因此為尋求適合MSC貼壁樣品篩選條件，我們做了以下測試：

• 板A1-3篩選圓度范圍為0.5-1，板A4縮小圓度范圍為0.7-1，直徑范圍均為15-25μm。

• 表1中“手工-LD”部分結果包括多克隆團，因此表2中 LD方法“D15單克隆率 < 20%”。

Cytena克隆篩選單細胞打印系統（single-cell printer™，scp™）采用芯片，能溫和、高效、快速的分選，既保證了D0高的單細胞率，又結合了高分辨率的光學系統，留下單細胞分選的“印跡”，通過設置細胞的直徑、細胞圓度、細胞熒光強度等質控方式，分選出“強壯”的細胞，利于后期克隆恢復，獲得高的單克隆率。

結論

SCP^TM所獲得貼壁的MSC單克隆率是手工-LD的3.67倍多！分選條件設置為：圓度范圍在0.5-1，直徑范圍在15-25μm，更適合于MSC樣品的單細胞篩選！這也說明了SCP^TM可以很好的應用于MSC單克隆細胞株的篩選，助力于MSC細胞在細胞治療、基因治療、組織工程以及再生醫學等領域的發展！