Ind Crop Prod（IF=6.2）|DAP-seq助力揭示ERF194調(diào)控楊樹葉片發(fā)育的機(jī)制

2025年7月31日，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)王升級(jí)團(tuán)隊(duì)在Industrial Crops&Products期刊發(fā)表了一篇題為“ERF194 regulates poplar leaf development via the starch and sucrose metabolism under natural environments”研究論文。本研究聚焦楊樹ERF194轉(zhuǎn)錄因子，借助DAP-seq技術(shù)揭示了其通過調(diào)控淀粉-蔗糖代謝通路影響葉片發(fā)育的分子機(jī)制，為楊樹遺傳改良提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。

文章主要內(nèi)容

研究背景

葉片是植物光合作用的核心器官，其形態(tài)與結(jié)構(gòu)直接影響植物生長(zhǎng)效率與抗逆能力。ERF轉(zhuǎn)錄因子家族作為植物的調(diào)控因子，在生長(zhǎng)發(fā)育與逆境響應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但此前其在楊樹葉片發(fā)育中的具體調(diào)控機(jī)制，尤其是與碳代謝通路的關(guān)聯(lián)尚未明確。

團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，室內(nèi)條件下過表達(dá)ERF194會(huì)導(dǎo)致楊樹出現(xiàn)半矮化表型，但該表型在自然環(huán)境中的穩(wěn)定性及背后的分子機(jī)制尚不清楚。

為探索上述問題，團(tuán)隊(duì)引入多組學(xué)分析策略，并借助藍(lán)景科信DAP-seq技術(shù)，深入挖掘ERF194的下游靶基因，最終揭開了其調(diào)控葉片發(fā)育的分子密碼。

研究結(jié)果

1. 田間表型驗(yàn)證：ERF194抑制葉片大小，增強(qiáng)葉片結(jié)構(gòu)致密性

為評(píng)估自然環(huán)境條件下ERF194調(diào)控楊樹葉片發(fā)育功能的穩(wěn)定性與保守性，對(duì)經(jīng)過田間持續(xù)修剪的1年生轉(zhuǎn)基因楊樹進(jìn)行了表型檢測(cè)。結(jié)果顯示，在自然環(huán)境條件下，ERF194過表達(dá)顯著抑制楊樹的株高和基莖生長(zhǎng)，而RNAi株系與野生型無明顯差異，表明ERF194對(duì)楊樹生長(zhǎng)的抑制作用穩(wěn)定且不受環(huán)境影響。葉片形態(tài)分析顯示，OE株系第15片成熟葉的葉長(zhǎng)、葉寬、周長(zhǎng)和面積均顯著小于WT，RNAi株系與WT無顯著差異，表明ERF194在楊樹葉片表型調(diào)控中發(fā)揮抑制作用。葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，盡管ERF194過表達(dá)導(dǎo)致葉片變小和中脈變薄，但整體葉片厚度顯著增加。OE株系的葉片細(xì)胞間隙減少，組織結(jié)構(gòu)更致密，柵欄組織和海綿組織均顯著增厚，上表皮細(xì)胞變小但密度增加。而RNAi株系與WT結(jié)構(gòu)相似，表明ERF194促進(jìn)細(xì)胞分裂、抑制細(xì)胞擴(kuò)張，表明，ERF194在改變楊樹葉內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面起關(guān)鍵作用。

圖1. ERF194抑制楊樹在自然環(huán)境條件下的生長(zhǎng)

圖2. 在自然環(huán)境條件下ERF194可減小楊樹葉大小

圖3. ERF194增加葉片厚度和內(nèi)部細(xì)胞的致密性

2. 代謝機(jī)制解析：靶向抑制淀粉-蔗糖代謝關(guān)鍵產(chǎn)物，限制葉片生長(zhǎng)

為深入了解葉片內(nèi)部變化的潛在機(jī)制，作者對(duì)葉片進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，共檢測(cè)到308種代謝物，其中76種在過表達(dá)株系中表現(xiàn)出顯著差異。KEGG富集分析顯示這些差異代謝物主要參與淀粉和蔗糖代謝、次生代謝物合成等通路。其中過表達(dá)株系中α,α-海藻糖和6-磷酸海藻糖含量顯著下降，OE株系葉片中蔗糖含量比WT降低15-37.6%，上述結(jié)果表明，ERF194基因的過表達(dá)會(huì)抑制楊樹葉片中 α,α- 海藻糖和6 - 磷酸海藻糖的合成，進(jìn)而導(dǎo)致蔗糖含量下降。進(jìn)一步通過RNA-seq分析，鑒定出2028個(gè)DEGs（1057上調(diào)、971下調(diào)），其中17個(gè)參與淀粉和蔗糖代謝。代謝組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析顯示，差異表達(dá)基因與差異代謝物之間存在強(qiáng)相關(guān)性，差異代謝物α,α- 海藻糖、6 - 磷酸海藻糖，與17個(gè)差異表達(dá)基因共同富集于淀粉與蔗糖代謝通路，ERF194通過調(diào)控這17個(gè)差異表達(dá)基因的表達(dá)，在淀粉與蔗糖代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖4. 過表達(dá)ERF194的轉(zhuǎn)基因楊樹（OE）與WT樣本的代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

圖5. ERF194參與調(diào)控淀粉代謝途徑

3. 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：DAP-seq助力鎖定“上游 - 核心 - 下游”完整調(diào)控鏈

為探究ERF194的下游基因，作者開展了DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）分析，在全基因組范圍內(nèi)篩選ERF194結(jié)合的DNA位點(diǎn)，為調(diào)控網(wǎng)絡(luò)解析提供精準(zhǔn)靶點(diǎn)：

l靶基因篩選：DAP-seq 結(jié)果顯示，ERF194可結(jié)合19條染色體上的15152個(gè)位點(diǎn)，其中6127個(gè)位于基因啟動(dòng)子區(qū)，通過與轉(zhuǎn)錄組DEGs聯(lián)合分析，鎖定287個(gè)核心靶基因，其中6個(gè)參與淀粉和蔗糖代謝，包括直接靶基因HKL1和FRK1；

l關(guān)鍵motif鑒定：發(fā)現(xiàn)ERF194通過識(shí)別LTRE（YCACCGACMHH）和SORLIP1（CCDCCRCCRCC）兩種保守motif結(jié)合靶基因啟動(dòng)子，酵母單雜交（Y1H）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該結(jié)合的特異性；

l調(diào)控模塊確立：結(jié)合多層級(jí)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ML-hGRN）分析，最終構(gòu)建 “SRM1/MYB61（上游調(diào)控因子）-ERF194（核心因子）-HKL1（下游靶基因）” 調(diào)控模塊，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ERF194可直接結(jié)合HKL1啟動(dòng)子并激活其表達(dá)，進(jìn)而抑制海藻糖合成，完成對(duì)葉片發(fā)育的調(diào)控。

圖6. 通過DAP-seq和Y1H鑒定楊樹全基因組中ERF194的下游靶點(diǎn)

圖7. 由ERF194介導(dǎo)的多層級(jí)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖8. ERF194調(diào)控楊樹葉發(fā)育的機(jī)制模型