DAP-seq助力揭示PagHSF4調(diào)控楊樹生長發(fā)育與耐鹽性的分子機(jī)制

2025年7月29日，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)王升級(jí)團(tuán)隊(duì)在Industrial Crops & Products期刊發(fā)表了一篇題為“PagHSF4 mediates the biosynthesis of jasmonic acid and plant hormone signal transduction to regulate the growth and development as well as salt stress tolerance of poplar”研究論文。該研究借助DAP-seq技術(shù)，鑒定出PagHSF4多個(gè)關(guān)鍵下游靶基因，為深入解析PagHSF4調(diào)控楊樹生長發(fā)育與鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)依據(jù)。藍(lán)景科信為該研究提供了DAP-seq技術(shù)支持。

文章主要內(nèi)容

研究背景

植物作為固著生物，需通過復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（含轉(zhuǎn)錄因子、激素信號(hào)等）適應(yīng)環(huán)境并調(diào)控生長，其中熱休克因子（HSFs）是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為A、B、C三類。目前研究多聚焦于功能廣泛的A類HSFs，而B類HSFs因被認(rèn)為主要參與脅迫響應(yīng)，其在植物生長發(fā)育中的作用長期被忽視。楊樹作為重要的工業(yè)用材林樹種，具有生長快、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，但鹽脅迫等環(huán)境因素嚴(yán)重制約其生長與產(chǎn)量。此前研究發(fā)現(xiàn)，楊樹HSF家族中部分成員參與逆境響應(yīng)，卻鮮有研究揭示B類HSFs如何協(xié)同調(diào)控生長發(fā)育與脅迫耐受。

研究結(jié)果

前期研究發(fā)現(xiàn)楊樹HSF4（HSFB1）具組織特異性表達(dá)，受多激素誘導(dǎo)且在鹽脅迫下被誘導(dǎo)。本研究從84K楊中克隆該基因并命名為PagHSF4。鹽脅迫表型分析顯示，PagHSF4在楊樹葉、根中持續(xù)上調(diào)，分別于12h、24h達(dá)峰值；亞細(xì)胞定位證實(shí)其定位于細(xì)胞核；酵母轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)顯示其無轉(zhuǎn)錄激活能力，同時(shí)其C端存在抑制基序，表明其可能為轉(zhuǎn)錄抑制因子。

圖1. PagHSF4基因在鹽脅迫下的表達(dá)模式及編碼蛋白的特征

為了探究PagHSF4功能，作者構(gòu)建了楊樹PagHSF4過表達(dá)（OE）和抑制表達(dá)（RS）轉(zhuǎn)基因株系，選取其中PagHSF4表達(dá)水平最高的過表達(dá)株系（OE1、OE4）和表達(dá)水平低的抑制株系（RS5、RS4）進(jìn)行后續(xù)的功能分析。結(jié)果表明，PagHSF4過表達(dá)會(huì)抑制楊樹株高生長與生物量積累、減少莖節(jié)數(shù)、增加莖粗、增大葉片面積（細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞大小不變）、減小氣孔孔徑、伸長葉柄長度，揭示了該基因?qū)ιL發(fā)育的精細(xì)調(diào)控作用。

圖2. 不同楊樹品系的生長表型和指標(biāo)分析

圖3. 不同楊樹品系的葉片表型和指標(biāo)分析

圖4. 不同楊樹品系葉片腹表皮的掃描電鏡觀察結(jié)果

圖5. 不同楊樹品系的葉柄表型和指標(biāo)分析

為解析PagHSF4調(diào)控的楊樹下游基因，作者對(duì)OE與WT株系的不同組織進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)葉柄中的差異表達(dá)基因（DEGs）數(shù)量最多（1648個(gè)），莖（1246個(gè)）、葉（625個(gè)）、芽（609個(gè)）、根（345個(gè)）次之。GO與KEGG分析顯示，差異表達(dá)基因在與植物生長發(fā)育相關(guān)的多個(gè)生物學(xué)過程和分子功能中顯著富集。在表型發(fā)生顯著變化的組織（葉片、葉柄、莖）中，差異表達(dá)基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的富集更為明顯，這表明植物激素在PagHSF4調(diào)控的楊樹生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖6. 不同組織的RNA-seq分析

為解析PagHSF4的分子調(diào)控機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)采用DAP-seq技術(shù)進(jìn)行全基因組結(jié)合位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示：

結(jié)合位點(diǎn)特征：PagHSF4在楊樹19條染色體上均有結(jié)合峰，且在基因外顯子（32.1%）、內(nèi)含子（28%）和啟動(dòng)子區(qū)域（11%）富集，尤其在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）下游結(jié)合活性更高。

識(shí)別關(guān)鍵基序：通過motif分析，發(fā)現(xiàn)PagHSF4可特異性結(jié)合兩種熱休克元件（HSE）——“KCTTCTAGAAV”和“AGAASMTTCYA”，這與HSF家族結(jié)合HSE調(diào)控下游基因的經(jīng)典機(jī)制一致。

靶基因功能富集：啟動(dòng)子區(qū)域共鑒定出2632個(gè)直接靶基因（DTGs）。這些基因顯著富集于氣孔關(guān)閉調(diào)控、系統(tǒng)獲得性抗性、活性氧響應(yīng)等通路。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，進(jìn)一步篩選出7個(gè)核心靶基因（LHY2、PIF3、MBF1C、TCF1、MGD2、HMP41、TBL38），并通過RT-qPCR、酵母單雜交（Y1H）和熒光素酶（LUC）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PagHSF4通過結(jié)合這些基因啟動(dòng)子的HSE元件，顯著下調(diào)其表達(dá)。

其中，LHY2是楊樹晝夜節(jié)律與休眠調(diào)控的關(guān)鍵基因，PIF3參與光信號(hào)與逆境響應(yīng)，MBF1C和TCF1則與脅迫耐受相關(guān)，這些靶基因的發(fā)現(xiàn)為PagHSF4調(diào)控生長與脅迫響應(yīng)的“橋梁作用”提供了分子依據(jù)。

圖7. 通過DAP-seq獲得的楊樹中PagHSF4全基因組結(jié)合位點(diǎn)

圖8. RNA-seq與DAP-seq的聯(lián)合分析

圖9. PagHSF4對(duì)其下游靶基因調(diào)控作用的檢測

植物激素是連接基因調(diào)控與表型變化的重要信號(hào)分子。基因表達(dá)分析表明，由PagHSF4介導(dǎo)的楊樹生長變化，與多種激素響應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。作者通過激素代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在PagHSF4過表達(dá)的楊樹各組織中，過表達(dá)PagHSF4導(dǎo)致各組織中多種激素水平升高，其中葉、葉柄、莖（表型差異顯著）變化明顯，且三者中JA、JA-Val顯著上調(diào)，尤其莖中JA濃度遠(yuǎn)高于其他組織。差異表達(dá)基因（DEGs）和差異積累激素（DAHs）通路映射分析表明，過表達(dá)導(dǎo)致芽中激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多個(gè)與生長發(fā)育相關(guān)的基因下調(diào)，或致株高降低；葉片中ABA通路ABF基因上調(diào)，或促氣孔關(guān)閉；莖中JA合成相關(guān)酶基因上調(diào)，是JA大量積累的關(guān)鍵。

圖10.PagHSF4介導(dǎo)的不同組織中激素含量的變化

圖11. PagHSF4介導(dǎo)的信號(hào)通路

作者進(jìn)一步探究了PagHSF4調(diào)控鹽脅迫耐受性的作用與機(jī)制。表型分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，OE株系生長抑制更顯著，表明PagHSF4負(fù)調(diào)控楊樹鹽脅迫耐受性。通過RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下OE植株760個(gè)基因上調(diào)（富集于脅迫相關(guān)過程與通路）、299個(gè)基因下調(diào)（富集于生長發(fā)育相關(guān)過程與通路），且激素信號(hào)通路中促生長基因下調(diào)。以上結(jié)果表明，鹽脅迫下，PagHSF4可能通過抑制楊樹激素信號(hào)通路中促進(jìn)生長發(fā)育的關(guān)鍵基因表達(dá)發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。激素代謝組分析顯示，鹽脅迫下OE植株葉片3種生長素類激素水平降低、JA類激素（除MEJA）升高，莖中JA類激素升高、SA降低、ACC增加，葉片ABA-ald積累；葉與莖中JA、JA-Val均升高，SA變化有組織差異。綜上表明，JA類激素升高及葉片生長素降低可能是PagHSF4抑制楊樹鹽耐受性的關(guān)鍵。

圖12. 不同楊樹品系的鹽脅迫耐受性分析

研究總結(jié)

本研究系統(tǒng)解析了楊樹B類HSF基因的功能；通過DAP-seq技術(shù)構(gòu)建了PagHSF4的直接靶基因網(wǎng)絡(luò)，為轉(zhuǎn)錄因子研究提供了“基因結(jié)合 - 表達(dá)調(diào)控 - 表型變化”的完整證據(jù)鏈。為楊樹分子育種提供了關(guān)鍵基因資源——通過精準(zhǔn)調(diào)控PagHSF4表達(dá)，可在“生長速度”與“抗逆性”之間找到平衡，培育兼具速生和耐鹽特性的優(yōu)良楊樹品種。