ELISA實驗中的非特異性吸附的避免方法

非特異性吸附是指在固液界面上，溶液中的待測化合物由于靜電作用、疏水作用等非共價鍵作用力，被吸附到固體表面的現象。非特異性吸附會影響樣品的真實濃度和分析結果的精確性，導致標準曲線的提取回收率不一致，出現高濃度點信號偏高，低濃度點信號偏低的情況。此外，它還會影響色譜峰型和產生進樣殘留，從而影響結果的準確性。

避免ELISA實驗中的非特異性吸附，可以采取以下策略：

一、封閉步驟優化

1、?封閉劑選擇

優先使用1-5% BSA（牛血清白蛋白）或5%脫脂奶粉，封閉未結合位點。

對高背景樣本可嘗試酪蛋白（1%濃度）或商業封閉緩沖液。

2、?封閉條件控制

37℃封閉1-2小時或4℃過夜，確保充分覆蓋孔板表面。

封閉液需與樣本基質匹配（如血清樣本建議用含0.05% Tween-20的PBS）?。

二、樣品處理與稀釋

1、優化樣品稀釋：使用含0.5%-1%牛血清白蛋白（或0.1%白明膠）的溶液稀釋檢測血清和酶標記抗體，能增強特異性吸附。樣品首先用稀釋的健血清孵育，也有助于去除非特異性顯色。

2、控制酶標記抗體濃度：酶標記抗體濃度太高易出現假陽性，太低則不靈敏，需通過實驗確定待測樣品、酶標記抗體和抗抗體的最適濃度。

三、緩沖液與洗滌優化

1、合理使用添加劑：在洗滌液或稀釋液中添加吐溫20，其為非離子型表面張力物質，常用含吐溫20的PBS作洗滌劑或稀釋樣品和酶標抗體，使用量一般在0.06%-0.1%，洗滌效果比牛血清蛋白溶液（0.5%）好，能減少非特異性吸附并增強抗原抗體結合。

2、規范洗滌操作：正確的洗滌是保證ELISA結果可重復的關鍵步驟，無論是手工還是機器操作，都要通過洗滌消除殘留在板孔中未結合的物質及非特異性吸附的干擾物質，以達到分離游離和結合酶標記物的目的。

四、更換試劑或材料

如果懷疑是抗體或固相材料的問題，可以嘗試更換不同的抗體或使用不同材質的96孔板，以減少非特異性吸附。例如，如果使用的是玻璃基質的芯片，可以考慮更換為海藻酸基質的芯片，因為某些固相材料可能由多層基質組成，不同的材質可能會影響非特異性結合。

五、提高分析物的純度

盡可能去除分析物中的雜質，通過提高分析物的純度、使用高質量的緩沖試劑或對粗樣品進行處理（如離心）來減少非特異性結合。

六、實驗操作條件控制

1、控制溫育條件：反應一般需在25℃下進行4-5h，若要減少反應時間可升至37℃，雖對靈敏性和準確性稍有影響，但能將保溫時間縮短至2-3h，對結果影響不大，37℃因此被經常采用。同時，要嚴格按照試劑最佳反應模式控制溫育溫度和時間。

2、規范加樣操作：加樣時應將所加物加在ELISA板孔底部，避免加在孔壁上部，防止濺出和產生氣泡。對于間接ELISA標本，稀釋時要保證加樣準確，尤其稀釋倍數大時，很小的絕對誤差會導致較大相對誤差。

3、確保酶標儀性能穩定：酶標儀作為記錄測定結果的儀器，其性能穩定與否決定結果的可靠度，需保證其處于良好工作狀態。

通過這些方法的綜合應用，可以有效地減少ELISA實驗中的非特異性吸附，提高實驗的特異性和準確性。