【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】核磁共振方法除可獲得分子結(jié)構(gòu)信息外，還可觀測(cè)分子的動(dòng)態(tài)特性，這些可為闡明蛋白質(zhì)等生物大分子的功能機(jī)制提供重要信息。隨著高速魔角旋轉(zhuǎn)技術(shù)的發(fā)展，固體核磁譜分辨率大幅提高，從理論上突破了液體核磁觀測(cè)的分子量的限制，逐漸被運(yùn)用于研究磷脂膜環(huán)境中的膜蛋白等超大生物分子復(fù)合物體系的動(dòng)態(tài)構(gòu)象。但低信號(hào)強(qiáng)度和低分辨率限制了生物分子固體核磁研究的廣泛開展。自然界中氫原子和氟原子的旋磁比大、NMR信號(hào)強(qiáng)，是比較理想的NMR觀測(cè)對(duì)象。氟原子在生物分子結(jié)構(gòu)中極少存在，無觀測(cè)背景信號(hào)，是理想的NMR觀測(cè)探針。因此，氫檢測(cè)和氟檢測(cè)方法的發(fā)展可能顯著擴(kuò)展固體核磁在復(fù)雜生物體系中的運(yùn)用。
2023年8月23日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心史朝為課題組在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊ScienceAdvances上在線發(fā)表了題為“Fluoride permeation mechanism of the Fluc channel in liposomes revealed by solid-state NMR”的研究論文，研究團(tuán)隊(duì)以氟離子通道蛋白Fluc-Ec1作為研究對(duì)象，結(jié)合氘代和19F定點(diǎn)標(biāo)記方法，發(fā)展并優(yōu)化膜蛋白固體核磁氫檢測(cè)及氟檢測(cè)研究方案，為膜蛋白核磁研究提供新思路。
環(huán)境中的氟離子可通過弱酸積累效應(yīng)在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)積累，產(chǎn)生毒害作用。微生物通過F-膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將F-運(yùn)輸至體外進(jìn)而抑制其毒性作用。來自Fluc(fluoridechannel)家族的Fluc-Ec1蛋白是由130個(gè)左右的氨基酸組成的離子通道，具有獨(dú)特的雙重拓?fù)涠垠w的結(jié)構(gòu)，且對(duì)氟離子具有高度選擇性。靜態(tài)的F-通道蛋白的晶體結(jié)構(gòu)難以描述F-滲透的具體機(jī)制，F(xiàn)-通道蛋白被抗體類似物固定在一種構(gòu)象上。氟原子和氧原子相似的電子云密度以及分子動(dòng)力學(xué)模擬數(shù)據(jù)使得晶體結(jié)構(gòu)中極性軌道(polartrack)上的氟離子結(jié)合位點(diǎn)(F1and F2sites)引發(fā)爭(zhēng)議，另外突變體功能保留或喪失的機(jī)制目前仍不清楚。
研究團(tuán)隊(duì)通過觀測(cè)磷脂膜環(huán)境中的Fluc-Ec1在不同氟離子濃度中的構(gòu)象，結(jié)合基因密碼子擴(kuò)展方法，在蛋白質(zhì)前庭位置引入非天然氨基酸三氟甲基苯丙氨酸(tfmF)，設(shè)計(jì)19F-19F自旋擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了Fluc-Ec1存在新的氟離子結(jié)合位點(diǎn)(F0site)。研究團(tuán)隊(duì)利用1H-1H自旋擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)直接檢測(cè)水和蛋白質(zhì)的相互作用，通過氘代來減少氫原子的非相干背景，結(jié)合water-hNH譜圖以及自旋擴(kuò)散傳遞和衰減規(guī)律，得到了主鏈酰胺質(zhì)子和水分子的距離信息，證明了F1位點(diǎn)結(jié)合的是水，而不是氟。
此外，晶體學(xué)研究無法從結(jié)構(gòu)的角度解釋F80M突變體具有功能活性而F83M突變體喪失功能活性的現(xiàn)象，研究團(tuán)隊(duì)通過分別對(duì)比F80M、F83M和野生型蛋白脂質(zhì)體樣品的碳檢測(cè)譜圖，結(jié)合液體核磁共振技術(shù)驗(yàn)證loop 1突變體功能，發(fā)現(xiàn)loop 1是F83M突變體喪失通道活性的重要因素，進(jìn)一步揭示了loop 1在F-滲透過程中的重要性。綜上，研究團(tuán)隊(duì)更正了先前推測(cè)的氟離子通道離子配位位點(diǎn)，提出氟-水交替“water-mediated knock-on”的滲透模型，為全面理解Fluc通道中的滲透和門控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)張瑾、宋丹、李娟以及德國(guó)亞琛工業(yè)大學(xué)的Florian Karl Schackert為該論文的共同第一作者，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心史朝為特任研究員為該文章的通訊作者。中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的龔為民教授、田長(zhǎng)麟教授、項(xiàng)晟祺教授以及德國(guó)Jülich研究中心的Paolo Carloni和Mercedes Alfonso-Prieto教授團(tuán)隊(duì)也參與了該研究工作并給予了大力幫助。該研究得到了科技部、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)以及德國(guó)科學(xué)基金會(huì)的經(jīng)費(fèi)資助。 (合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心、科研部)
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