【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近期，中國科學(xué)院長春光機所在Light: Science & Applications發(fā)表了題為“Time-resolved photon counting Fourier-transform micro-spectroscopy enables simultaneous Raman and fluorescence lifetime imaging”的研究論文。本文第一作者為尚林東博士，通訊作者為李備研究員、Wolfgang Langbein教授。團隊創(chuàng)新性地開發(fā)了時間分辨光子計數(shù)傅里葉變換顯微拉曼光譜平臺。該技術(shù)巧妙融合了光子計數(shù)的高靈敏度和傅里葉變換光譜的寬譜高分辨優(yōu)勢，成功拓寬了可探測的光譜范圍并提升了光譜分辨能力。實驗結(jié)果有力證實，該儀器不僅能高效分離拉曼與熒光信號，更能同步實現(xiàn)高空間分辨率的拉曼與熒光壽命成像。
拉曼光譜是材料科學(xué)、半導(dǎo)體工業(yè)、環(huán)境測試、考古學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的重要工具。一個重要的限制是熒光背景，它可能會淹沒拉曼光譜信號。大多數(shù)拉曼光譜使用連續(xù)激光器激發(fā)信號，因此無法根據(jù)拉曼和熒光成分的時間動力學(xué)來分離拉曼和熒光成分(拉曼信號是瞬時的，熒光的典型壽命在納秒范圍內(nèi))。通常的做法是從測量的拉曼光譜中擬合光譜中的熒光寬背景，以消除熒光。然而這種做法會將部分拉曼信號一并扣除，會影響拉曼光譜的分析識別。為了真正實現(xiàn)熒光抑制這一問題，需要使用時間門控拉曼技術(shù)。目前，光柵式時間門控技術(shù)已有成功案例，但由于單光子雪崩二極管(SPAD)技術(shù)瓶頸，難以同時滿足高光譜分辨率、寬光譜范圍和高時間分辨率的需求。
本文提出了一種基于高分辨率傅里葉變換光譜儀和SPAD的時間門控拉曼系統(tǒng)。研究團隊設(shè)計了一個光子矩陣來存儲SPAD檢測到的光子事件，并開發(fā)了一種策略來校正所獲得的光子矩陣干涉曲線，以獲得高信噪比的時間分辨拉曼光譜。
圖1 傅里葉時間門控拉曼光譜儀光路圖
研究團隊采用馬赫曾德爾干涉儀結(jié)合高精度直線電機位移臺，并與單光子雪崩二極管、單光子計數(shù)器時間標記采集配合使用(圖1)，允許將光子事件按照發(fā)生絕對時間和相對時間順序放置在光子矩陣中(圖2a，b)。該矩陣橫軸疊加為干涉強度曲線，縱軸疊加為熒光壽命曲線(圖2c)。
圖2 記錄光子數(shù)據(jù)得到光子矩陣。
在傅里葉式干涉系統(tǒng)中，位移臺的校準一直是一個核心問題，由于本工作使用波長532nm的脈沖激光，相比傳統(tǒng)傅立葉式使用1064nm激光對位移臺校正精度要求更高，再加上本工作使用四倍光程差設(shè)計，使位移臺的移動錯誤放大了四倍，所以校正難度進一步增大。為了解決這些問題，本工作使用位置同步輸出(PSO)結(jié)合單模激光干涉相位擬合的方式對位移臺進行位置校正。從結(jié)果圖中可以看出經(jīng)過位置校正后激光譜線信噪比有了極大提升(圖3)。
圖3 高精度位移臺校正過程圖。
為了確定系統(tǒng)整體時間分辨率和光譜分辨率，研究團隊首先使用脈沖激光測試其時間分辨率。從脈沖激光譜線2D、3D熱圖(圖4a，c)中可以看出該儀器實現(xiàn)了547 ps的時間分辨率(圖4b)。其次使用連續(xù)激光測試系統(tǒng)最大光譜分辨率，從圖中可以看到系統(tǒng)最大可實現(xiàn)的光譜分辨率為0.05 cm-1(圖4d，e)。
圖4 系統(tǒng)時間分辨率和最大光譜分辨率結(jié)果圖。
為了驗證系統(tǒng)的拉曼熒光信號分離能力。團隊使用在表面涂覆熒光材料的硅片進行實驗(R6G-PVA-Si)。圖5a為樣品掃描結(jié)果熱圖(時間延遲 -1000-50000ps.光譜范圍為-500-10000cm-1)。將熱圖按照時間延遲進行區(qū)域劃分可以設(shè)置為拉曼區(qū)域，拉曼熒光混合區(qū)域，熒光區(qū)域。圖5b為不同區(qū)域的光譜均譜。可以看到在拉曼區(qū)域有明顯的硅峰信號，而隨著時間延遲增大，熒光信號開始顯現(xiàn)，直到無法看到硅峰信號。結(jié)果證明了系統(tǒng)的拉曼熒光分離能力。
圖5 R6G-PVA-Si 樣本拉曼熒光分離結(jié)果圖。
為了進一步驗證系統(tǒng)的時間門控拉曼2D掃描能力，團隊使用熒光小球進行實驗驗證，我們?nèi)詫⑷珪r間延遲分為拉曼、拉曼熒光混合、熒光三大部分，從圖中可以清晰看到在拉曼延遲范圍內(nèi)，能夠獲得清晰的小球拉曼信號和2D掃描圖像。隨著時間延遲增加，在混合區(qū)域內(nèi)開始出現(xiàn)明顯的熒光信號。再隨著時間延遲增加，2D熱圖中就無法觀測到小球的拉曼信號了(圖6)。結(jié)果證實，該儀器能夠有效地分離拉曼信號和熒光信號。
圖6：用 5μm PMMA 和 2μm PS 塑料微球用 R6G染色后測試結(jié)果圖。
本研究提出傅里葉式光子計數(shù)時間門控拉曼光譜技術(shù)，巧妙地融合光子計數(shù)的高靈敏度與傅里葉變換光譜的寬譜高分辨優(yōu)勢，成功突破了傳統(tǒng)時間門控拉曼光譜在光譜范圍窄和分辨率低方面的核心限制。研究團隊通過嚴謹?shù)膶嶒烌炞C，證實了該平臺能夠高效分離拉曼與熒光信號，并在單次測量中實現(xiàn)兩種成像模態(tài)的精準同步，解決了長期以來難以兼顧光譜信息與熒光壽命信息的難題。這一突破性設(shè)計有望成為拉曼熒光抑制的關(guān)鍵技術(shù)，在化學(xué)、生物學(xué)、材料科學(xué)、藥物檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域展現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。
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